透射熒光顯微鏡與反射熒光顯微鏡的區(qū)別及優(yōu)缺點

1．透射式熒光顯微鏡：激發(fā)光源是通過聚光鏡穿過標(biāo)本材料來激發(fā)熒光的。常用暗視野集光器，也可用普通集光器，調(diào)節(jié)反光鏡使激發(fā)光轉(zhuǎn)射和旁射到標(biāo)本上．這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點是低倍鏡時熒光強，而缺點是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱．所以對觀察較大的標(biāo)本材料較好。

2．落射式熒光顯微鏡：這是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡，與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。光路中需加上一個雙色束分離器，它與光鈾呈45度角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時進入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數(shù)愈大熒光愈強。

透射熒光顯微鏡的優(yōu)點及缺點

光源：高壓汞燈或鹵素?zé)簟?/p>

聚光鏡：使用暗場聚光鏡，使激發(fā)光和熒光分離出來。

物鏡：可用任何種類的物鏡。

標(biāo)本：因為是透射觀察，薄的標(biāo)本比較適合。

優(yōu)點：①由于用了暗場聚光鏡，激發(fā)光不能進入物鏡，因此容易形成暗的背景，得到良好的反差，且任何物鏡都可用于觀察。②用低倍物鏡時，比反射熒光顯微鏡更亮。

缺點：必須正確調(diào)整聚光鏡中心和高度，否則不能獲得明亮的熒光像。由于暗視場聚光鏡焦距限制，不能使用厚的載玻片。視場照明區(qū)不能過大，否則容易使熒光標(biāo)本熒光色衰褪。厚的或不透明的標(biāo)本不適用。

反射熒光顯微鏡的優(yōu)點及缺點
光源：高壓汞燈或鹵素?zé)簟?/p>

聚光鏡：因為物鏡作為聚光鏡，所以不需要聚光鏡。

物鏡：所用物鏡必須能透過足夠的紫外光，而且本身不產(chǎn)生熒光，對數(shù)值孔徑?jīng)]有限制。

標(biāo)本：厚的標(biāo)本或不透明的標(biāo)本都能觀察。

優(yōu)點：①由于物鏡兼作聚光鏡，不需要很多調(diào)節(jié)。②采用柯拉照明法，可利用孔徑光闌和視場光闌的效果。③物鏡數(shù)值孔徑不受限制，在高放大倍率時，也可以獲得高分辨率的像。④厚的或不透明的標(biāo)本也能觀察，厚的蓋玻片也能使用。⑤其它觀察法也能與反射熒光結(jié)合使用，特別和相差法和透射微分干涉差法相結(jié)合。⑥可以避免不必要的熒光色衰褪現(xiàn)象。

缺點：在用地倍率物鏡時，像比較暗，因此必須用大數(shù)值孔徑的物鏡。濾光鏡系統(tǒng)必須有效地分離開激發(fā)光和熒光。